为了建立SPF级远交系ICR小鼠种群。使用超净工作台实施子宫摘除术净化小鼠, 结果:使用上述方法成功剖腹孕鼠20只, 得到净化小鼠140只, 育成小鼠120只, 检测各项指标符合SPF级标准。结论:在普通环境中使用超净工作台实施子宫摘除术净化ICR小鼠, 是建立SPF级种群唯一经济有效的方法。
ICR远交系小鼠引自日本国立肿瘤研究所, 属瑞士种。该鼠具有繁殖水平高、生产周期短、生长发育快、体型适中、对环境及饲喂适应性强等特点, 广泛应用于药物评价、毒性试验和生物医学研究等领域。随着生命科学的不断发展, 对实验动物提出了高标准严要求, 普通级实验动物只能用于教学或预实验, 科研用小鼠和大鼠必须达到清洁级 (排除动物传染病病原体和对实验干扰的病原体) 。青海省实验动物中心为满足省内需要, 于2002年由上海实验动物种子中心引进SPF (无特定病原体) 级ICR小鼠, 降为清洁级饲养在屏障系统中, 至今生产供应的数量达10万余只, 是目前用量最多的一种标准化清洁级实验动物。在保种和繁育生产过程中, ICR小鼠的微生物质量控制十分重要, 我们在2005—2006年间, 在超净工作台内进行了剖腹产净化ICR小 鼠的实验, 结合生物净化层流柜饲养技术, 有效地提高和保证了小鼠 微生物质量, 特别是在动物种群受细菌、病毒、寄生虫污染时立即全 部淘汰, 及时挽救、补充和重新建立SPF级种群, 避免反复引种造 成人力、时间、物力及财力的损失和浪费, 同时避免运输过程中的污 染, 结果表明使用本途径是维护和建立SPF级ICR小鼠群种群唯一经济有效的 办法, 填补了青海省实验动物净化工作空白, 为提高我省实验动物质量 奠定基础, 缩短与先进省市的差距。现将结果报告如下:
1材料和方法
1.1 实验室和设备
清洁级动物实验室、超净工作台、生物净化层流柜、隔水式恒温水浴锅、手术器械、消毒缸等。
实验室经2%过氧乙酸喷雾消毒, 开启空气净化系统, 在静态情况下运转2d。手术前lh开启超净工作台紫外线灯, 开启生物净化层流柜后一直保持于工作状态。手术器械、止血纱布棉球等物品经121℃, 35min高压蒸汽灭菌。
1.2 保姆ICR小鼠
为2002年从上海实验动物种子中心引进的 SPF级ICR小鼠, 合格证号:NO 0024361, 交配时间比剖腹产ICR小鼠提前3~4d。
1.3 剖腹的ICR小鼠
来自本中心普通级ICR小鼠, 饲养于普通环境, 交配时间比SPF级ICR小鼠延迟3~4 d, 交配后第2d提出雄鼠, 雌鼠单独饲养。
1.4 剖腹取仔方法
到预产期的孕鼠 (交配后20 d) , 断颈椎处死后, 立即用2%过氧乙酸浸泡2~3s, 然后置于超净工作台固定、剖腹, 用无菌止血钳夹住近肛门的子宫颈, 再用无菌剪从止血钳的肛门一侧剪断子宫, 取出子宫后, 置2%过氧乙酸浸泡1~2s, 快速切开子宫, 取出幼仔, 用无菌纱布将幼仔全身擦试干净, 擦去口、鼻部的羊膜、羊水, 切断脐带, 至体色由紫色转为鲜红色, 能够自由呼吸为止[1,2]。
1.5 代乳
在剖腹产所得的活幼仔中, 每只孕鼠的幼仔取6~8只, 用无菌运输盒转入生物净化层流柜中, 用SPF级ICR小鼠保姆代乳, 21d离乳, 然后将保姆鼠移出层流柜处死。
1.6 微生物检测
在1月龄和2月龄时, 随机抽取剖腹产小鼠按SPF级动物质量标准进行微生物和寄生虫检测, 以后每季度检测一次。
2 结果
2.1 剖腹净化到扩大生产
此次剖腹净化ICR小鼠共繁育成功20只孕鼠, 成活幼仔120只, 目前扩大成♀种180只, ♂种90只的生产种群, 月供600~900只, 生长繁育状况正常。
2.2 质量检测结果
按照实验动物国家标准要求, SPF级动物应排除的病毒6种:小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒、大鼠细小病毒RV株、大鼠细小病毒H-1株、大鼠冠状病毒/大鼠泪眼腺病毒;细菌4种:嗜肺巴氏杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌;寄生虫2种:鞭毛虫、纤毛虫[3]。经实验室检测, 病毒、细菌、寄生虫均为阴性, 符合我国SPF级动物质量标准[3]。
3 讨论
3.1 应用超净工作台和生物净化层流柜, 在开放环境中实施子宫摘除术净化小鼠, 能够建立和维护SPF级实验动物种群。由于超净工作台、生物净化层流柜的体积小、耗能低、易维护, 投入少量资金就能开展实验动物净化工作, 此项技术的应用, 避免了资金浪费, 减少反复引种和运输的污染, 最终解决就地开展实验动物净化的难题, 该项技术已应用到实验动物中心的实际工作中, 收到良好效果。
3.2 由于环境条件是保证实验动物质量的关键, 因此, 首先对静态状态下设备内外环境进行检测, 制定合理有效的微生物寄生虫控制措施和剖腹产无菌操作规程, 并且定期抽检动物的微生物和寄生虫指标。通过实验观察还发现, 由于青海气候干燥, 饲养环境湿度为30%, 可以通过使用加湿器使湿度达到规定的40%, 是实际工作中应引起注意的一个问题。
