目的 探讨频繁开关培养箱引起温度和CO2浓度的变化对大规模培养脐带间充质干细胞 (UC-MSCs) 的影响。方法 取P3代UC-MSCs, 在37℃、5﹪?CO2培养条件下, 模拟操作中不同的开关培养箱次数 (每天0、5和10次) , 以及每次不同的开箱时间 (1、2和3min) , 对比分析细胞生长形态和增殖数量的差异。结果 同样开箱次数, 随着每次开箱时间的增长细胞增殖速度减慢, 1、2和3min各组细胞增殖数量差异均有统计学意义 (F=265.0, P=0.000;F=1434.61, P=0.000) ;同样开箱时间条件下, 每天开箱10次组比5次组细胞增殖数减少, 差异有统计学意义 (t值为16.400, 17.280, 4.480, P均?=0.000) 。随着开箱时间的延长, 开箱次数增加, 可以明显看到细胞胞浆内出现空泡和成片死亡脱落的细胞。结论 频繁开关培养箱及开关箱时间长短均可影响脐带MSCs的增殖, 同时对细胞形态有明显影响。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞。近年来，干细胞广泛应用于心血管疾病、神经系统疾病、糖尿病和创伤等各种疾病的研究[1]。脐带来源广泛，取材方便，易于采集保存。脐带采集对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，脐带来源的间充质干细胞（umbilical cord derived mesenchymal stem cells, UC-MSCs）已成为近年研究的新热点。在UC-MSCs细胞培养过程中，通过对同一根脐带分离出的脐带间充质干细胞，在不同开关箱次数情况下，P3代培养3 d，脐带间充质细胞形态观察和数量统计，相同细胞的生长速度和质量存在差异。本文主要探讨大规模培养MSCs 过程中频繁开关培养箱造成温度和CO2浓度的变化对细胞生长情况的影响，报道如下。

材料和方法

一、脐带来源

脐带取自福州总医院2009年9月至2010年9月健康足月产新生儿，病原学检查阴性，经产妇知情同意后无菌留取。

二、仪器试剂

CO2温培养箱 （日本，SANYO公司），LG-DMEM培养基  (美国，Hyclone公司) ，胎牛血清FBS (美国，Hyclone公司) ，75 cm2培养瓶 （美国，Costar公司），0.25﹪胰酶 (美国，Gibco公司) 。

三、UC-MSCs 的分离与培养

取新鲜足月产新生儿脐带，磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer saline, PBS) 冲洗，剔除动静脉，分离出沃顿胶，0.1﹪Ⅳ胶原酶消化过夜，0.25﹪胰酶消化60 min，离心洗涤，用含10﹪胎牛血清的LG-DMEM培养基接种，培养72 h换液，以后每3 d换液1次，长到80﹪融合时，用0.25﹪胰酶消化、传代。镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表面抗原。

四、开关箱实验 

取P3代细胞，以2×105/75 cm2的密度接种，分成7组，每组6瓶细胞，置于7个37℃、5﹪CO2的培养箱中培养，对照组培养过程中不开关培养箱，其它6组分别模拟培养操作中不同的开关培养箱次数（每天5次、10次），以及每次不同的开箱时间（1、2和3 min）。第4天取出，倒置显微镜下观察细胞形态及密度分布，0.25﹪胰酶消化，600×g离心5 min，重悬计数，比较细胞增殖情况。

五、统计学分析

应用统计软件SPSS 13.0进行统计分析， 对照组和实验组细胞计数结果以 x±s的形式表示，各组间差异显著性检验采用单因素方差分析（ANOVA），以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、细胞形态观察

镜下观察细胞形态和分布，对照组UC-MSCs 为梭形或不规则多边形，呈鱼群样分布，细胞大小均匀，细胞折光性强，高倍镜下，胞浆内空泡极少或未见空泡；开关培养箱组细胞大小不均，高倍镜下，细胞胞浆内空泡数量增多，随着开关箱次数增多和时间延长，细胞形态越差。（图1)

二、细胞数量比较

正常对照组细胞计数为（5.30±0.08）×106。所有实验组与正常对照组相比较，细胞增殖数量均明显减少。开关箱培养组中，相同开箱次数，随着每次开箱时间的延长细胞增殖速度减慢，不同组细胞增殖数量之间比较差异有统计学意义（F=262.50, F=1434.62, P=0.00, P=0.00）；同样开箱时间条件下，每天开箱10次比5次细胞增殖数减少，具有统计学意义 （t=16.40, t=17.28, t=4.48, P=0.00, P=0.00, P=0.00）；在开箱10次，每次3 min的细胞图片上明显看到细胞片状死亡脱落（倒置显微镜下×100倍）。（表1，图2, 3）